シングルセルシーケンシングのための深層学習：細胞の多様性を見る顕微鏡

![image](https://thegradient.pub/content/images/2024/01/image4.jpg) 生きているすべての生物の歴史は、そのゲノムに記されています。ゲノムは DNA として保存され、体内のほぼすべての細胞に含まれています。同じ DNA を持ち、同じ細胞種であっても、2 つの細胞が完全に同一であることはありません。なぜなら、DNA がどのように発現するかを制御する調節因子において違いがあるからです。 ヒトのゲノムは、30 億塩基対からなり、23 本の染色体に広がっています。この膨大な遺伝コードの中には、約 2 万から 2 万 5 千個の遺伝子があり、タンパク質をコードする DNA を構成し、全ゲノムの約 1% を占めています [1]。 体内の複雑なシステム、特にこの小さなコーディング領域の機能を探求するためには、精密なシーケンシング手法が必要であり、シングルセルシーケンシング（sc-seq）技術がこの目的に最適です。 2013 年、Nature は単一細胞 RNA シーケンシングを「今年の手法」に選定しました [2]（図 3）。これは、個々の細胞レベルで DNA および RNA をシーケンシングすることで細胞の多様性を探索する上でこの手法が極めて重要であることを強調したものです。その後、単一細胞 RNA シーケンシングデータの解析のための多数のツールが登場しました。例えば、scRNA-tools データベースは 2016 年から単一細胞 RNA データの解析ソフトウェアを収集し始めており、2021 年までに 1000 以上のツールが登録されています [3]。これらのツールの多くには深層学習（Deep Learning）技術を活用した手法が含まれており、本稿ではこれらに焦点を当てます。特に、単一細胞シーケンシング技術の進展における鍵となる推進役として深層学習が果たしてきた決定的な役割について探求していきます。 背景 細胞内における遺伝情報の DNA からタンパク質への流れ まず、細胞と配列が具体的に何を指すのかを確認しましょう。細胞は私たちの体の基本単位であり、体が健康に機能する仕組みや、分子の機能不全がどのように疾患につながるかを理解するための鍵です。私たちの体は数兆個の細胞で構成されており、ほぼすべての細胞には遺伝情報の3つの層、つまりDNA、RNA、タンパク質が含まれています。DNAは各人を独自のものにする遺伝コードを含む長い分子です。ソースコードのように、体内の各タンパク質をどのように作るかを示す複数の命令を含んでいます。これらのタンパク質は細胞の主要な働き手であり、細胞生命に必要なほぼすべてのタスクを実行します。例えば、細胞内の化学反応を触媒する酵素や、細胞分裂中のDNA複製に関与するDNAポリメラーゼもすべてタンパク質です。細胞はタンパク質を2段階で合成します：転写と翻訳（図1）であり、これらは遺伝子発現として知られています。まずDNAがRNAに転写され、その後RNAがタンパク質に翻訳されます。RNAはDNAとタンパク質の間のメッセンジャーと考えることができます。 ![image](https://lh7-us.googleusercontent.com/FE0jl7A1RgTBL5tPgpxsw624oxkwsWMLx3lRvyCQYwjLLLIezvRjxHONrVsJ8IJEx1EjZkTklRUD09IPg4JxBLq_goJPdCDy3PH5kA0EPntuMIhso_8R0Vouja3yZtU4rG1eYGarcsGjT4naVbPD2Q)図 1.生物学の中心原理 私たちの体の細胞はすべて同じ DNA を共有していますが、生物学的な活動には違いがあります。例えば、免疫細胞と心臓細胞の違いは、これらの細胞内で活性化または不活性化されている遺伝子によって決定されます。一般的に、ある遺伝子が活性化されると、より多くの RNA コピーが作られ、タンパク質の産生が増加します。したがって、細胞の種類は合成される RNA/タンパク質分子の数と種類に基づいて異なるため、単一細胞レベルでこれらの分子の存在量を評価することは興味深いことです。これにより、各細胞内の DNA の挙動を調査し、体のさまざまな部分について高解像度の視点を得ることが可能になります。 一般的に、すべての単一細胞シーケンシング技術は、以下の 3 つの主要なステップに分類できます: 関心のある組織から単一細胞を分離し、各分離された細胞から遺伝物質を抽出する 各分離された細胞からの遺伝物質を増幅し、ライブラリー調製を行う 次世代シーケンサーを用いてライブラリーをシーケンシングし、データ解析を行う 細胞生物学および単一細胞シーケンシング技術の複雑なステップをたどる中で、決定的な問いが生じます：単一細胞シーケンシングデータはどのように数値的に表現されるのでしょうか？ 単一細胞シーケンシングデータの構造 単一細胞シーケンシングデータの構造は行列（図 2）の形式をとります。ここで各行はシーケンシングされ、一意のバーコードで注釈付けされた細胞に対応します。行数は実験で解析された細胞の総数に等しくなります。一方、各列は特定の遺伝子に対応します。遺伝子はゲノムの機能単位であり、タンパク質や他の機能的分子の合成のための指示を符号化するものです。scRNA seq データの場合、行列内の数値エントリは個々の細胞における遺伝子の発現レベルを表します。これらの値は、特定の細胞内で各遺伝子から産生される RNA の量を示し、異なる細胞内での遺伝子の活性に関する洞察を提供します。 ![image](https://lh7-us.googleusercontent.com/qTHPAYL5g0S2KEbMKrt3HXoqTmPqeGpo2cqPyFN_NXzE_jUgC1H7C67igubfJOY_mfLXyILiPlQxW0Z3FOdisQ6wZ9cnN72mqeJJ9_Aa2x7qs79DHAgsZtuJjrMXpRe79TNtEhrpb10hqofcO_9aTA)図 2. 単一細胞シーケンシングデータのスキーマ Single Cell Sequencing Overview 150 年以上にわたり、生物学者たちは人体を構成するすべての細胞タイプを同定し、その性質の正確な記述に基づいて明確なタイプに分類することを望んできました。ヒトゲノムプロジェクト [4] の遺伝子版である「ヒト細胞アトラス・プロジェクト（HCAP）」は、人体内のすべての細胞をマッピングするための国際的な共同取り組みです。「私たちはヒト細胞アトラスを、人体を一貫性かつ体系的に描き出そうとする地図の試みとして概念化できます。Google マップが複雑な詳細をより詳しく観察するためにズームインできる機能を提供するように、ヒト細胞アトラスは空間情報や内部属性、さらには要素間の関係性についての洞察をもたらします」と、MIT とハーバード大学の Broad Institute に所属する計算生物学・システム生物学の専門家であり、ジェネンテック社の研究担当執行副社長であるアビブ・レゲヴ氏は説明しています。 この比喩は、単一細胞シーケンシングのより広範な影響と見事に一致しており、これは集団全体ではなく個々の細胞を分析することを可能にします。この技術は、発生プロセスに関連する複雑な生物学的問いへの対応や、さまざまな治療条件や疾患状態における不均質な細胞または遺伝的変化の理解において極めて貴重なものとなります。さらに、特定の細胞集団内に存在する新たな細胞種の同定も容易にします。2009 年に最初の単一細胞 RNA シーケンシング（scRNA-seq）論文 [5] が発表され、その後 2013 年に「年の技術」[2] と指定されたことは、単一細胞トランスクリプトームの複雑さを解明するために実験手法と計算手法の双方を進展させるという広範な取り組みの始まりを示すものです。 技術環境が進化するにつれて、物語は単一細胞研究の進展へと移行し、特に複雑な細胞集団を研究する際の費用対効果の高さから、初期には単一細胞 RNA 配列解析（scRNA-seq）に焦点が当てられてきました。「ある意味では、RNA は測定しやすいものの一つでした」と、ニューヨークゲノムセンター（NYGC）の研究者である Satija [6] は述べています。しかし、単一細胞技術の急速な発展は、多様性のある可能性を切り開く新たな時代、すなわちマルチモーダル単一細胞データ統合の幕開けをもたらしました。これは Nature [7] によって「2019 年の手法」として認定され（図 3）、同じ細胞内でゲノム、エピゲノム、プロテオームなど、異なる細胞モダリティを測定することを可能にします。複数の情報層を重ね合わせることで細胞の正体に関する強力な洞察が得られる一方、マルチモーダル測定から生成されたデータセットを効果的にモデル化し統合する課題も生じます。この統合への挑戦は、Multi-view learning [8] 手法の導入によって対処され、モダリティ間での共通の変異を探求します。深層学習技術を組み込んだこの洗練されたアプローチは、生物学や生物医学をはじめとする様々な分野で関連する成果を示しています。 これらの進展の中で、単一細胞 RNA シーケンシングの永続的な限界である、細胞を元の位置から分離することで転写体プロファイリング中に空間情報が失われるという明確な課題が浮上しています。空間分解能トランスクリプトミクス（SRT）は、複雑な生物系を研究する際に空間の詳細情報を保持することにより、この課題に対処する決定的な解決策として登場しました [9]。2020 年の「今年の手法」として空間分解能トランスクリプトミクスが認識されたことは、複雑な生物系に対する理解を深めることに内在する課題に対する重要な解決策としての地位を確固たるものにするものです。 ![image](https://lh7-us.googleusercontent.com/wuqGlu6SprK1ganCDuvgJLJqHhfPhGHpO2xZTSYQ0orB3PLdbAhYwZNXUPVrbRWjH9bHimSgLOsEEDhTKZumcHovsqUqEGo5GILDf74QkaXAiqdpGUdjbda7XYsmrqbsh9sH_ASz6auWXTCtSbHF4g)図 3. 時系列における単一細胞シーケンシングの進化 単一細胞シーケンシングのパノラマを探求した後、今度は単一細胞シーケンシングの文脈におけるディープラーニングの役割について深く掘り下げていきましょう。 単一細胞シーケンシングにおけるディープラーニング 深層学習は、単一細胞シーケンシングデータの複雑性を処理する能力により、単一細胞解析においてますます採用されています。一方、従来の機械学習アプローチでは、ドメインの専門家によって設計される特徴量エンジニアリング戦略の開発に多大な労力を要します。しかし、深層学習アプローチは、単一細胞シーケンシングデータから関連する特性を自律的に捉えることで、単一細胞シーケンシング実験間の不均質性や、そのようなデータに伴うノイズおよびスパース性を解決します。以下に、単一細胞シーケンシングにおける深層学習の適用に関する3 つの主要な理由を示します。 高次元データ：単一細胞シーケンシングは、各細胞について数千の遺伝子とその発現レベルを測定する高次元データを生成します。深層学習モデルは、このデータ内の複雑な関係やパターンを捉えるのに優れており、これは従来の統計手法では困難な場合があります。 非線形性：単一細胞遺伝子発現データは、遺伝子発現間および細胞間の不均質性の間に内在する非線形性を特徴としています。従来の統計手法は、単一細胞遺伝子発現データに存在する非線形関係を捉えることに困難を抱えます。一方、深層学習モデルは柔軟であり、複雑な非線形マッピングを学習できる能力を持っています。 不均一性：単細胞データは、遺伝子発現プロファイルが異なる多様な細胞集団を特徴とし、複雑な景観を示します。ディープラーニングモデルは、これらの固有の細胞種やサブ集団を同定し、クラスタリングし、特徴づける上で重要な役割を果たす可能性があり、これによりサンプル内の細胞不均一性に対するより深い理解が促進されます。 単細胞シーケンシングデータにおけるディープラーニングの使用理由を探求するにつれ、次の疑問が生じます：sc-seq データ解析にはどのようなディープラーニングアーキテクチャがよく用いられているのでしょうか？ オートエンコーダーの背景 オートエンコーダー（AE）は、GAN や RNN などさまざまな深層学習アーキテクチャの中で、単一細胞シーケンシングデータの複雑さを解読するための特に信頼性の高い手法として際立っています。これは、単一細胞シーケンシングデータに内在する不均質性を保持しながら次元削減を行うために広く採用されています。オートエンコーダーによって生成された低次元空間で細胞をクラスタリングすることで、研究者は異なる細胞種やサブ集団を効果的に同定し特徴づけることができます。このアプローチにより、単一細胞データセット内の多様な細胞成分を識別・分析する能力が向上します。Seurat [10] などの確立された scRNA-seq データ解析ソフトウェアに不可欠な構成要素である主成分分析（PCA）のような非深層学習モデルとは対照的に、オートエンコーダーは非線形多様体を解明することで独自性を発揮します。PCA が線形変換に制約されるのに対し、複雑な非線形マッピングを捉えるためのオートエンコーダーの柔軟性は、単一細胞ゲノミクスに埋め込まれた微妙な関係性を見つけるための先進的な手法となっています。 オートエンコーダーに関連する過学習の課題を緩和するため、sc-seq データの文脈において特に利点を提供するように設計された、いくつかの構造上の改良が実施されています。sc-seq データの文脈でよく用いられる顕著な適応の一つに、ノイズ除去オートエンコーダー（Denoising Autoencoder: DAEs）があります。これは、初期ネットワーク層にノイズを導入することで、オートエンコーダーの再構成能力を強化するものです。具体的には、ユニットの一部をランダムにゼロに変換します。その後、ノイズ除去オートエンコーダーは、この意図的に損なわれたバージョンから入力データを再構築し、ネットワークがより関連性の高い特徴を捉えるようにし、単に入力を暗記してしまう（過学習）ことを防ぎます。この改良により、モデルのデータノイズに対する耐性が大幅に強化され、sc-seq データから導出されるサンプルの低次元表現（すなわちボトルネック）の品質が向上します。 sc-seq データ解析において頻繁に用いられるオートエンコーダーの第 3 の変種として、variational autoencoders (VAEs) が挙げられます。これは scGen [19]、scVI [14]、scANVI [28] などのモデルによって具体化されています。VAE は生成モデルの一種であり、データの潜在表現分布を学習します。データを p 次元の潜在変数のベクトルとして符号化するのではなく、データはサイズが p の 2 つのベクトルに符号化されます。すなわち、平均値 η を表すベクトルと標準偏差 σ を表すベクトルです。VAE は符号化プロセスに確率的要素を導入し、合成単一細胞データの生成を可能にし、細胞集団内の多様性に関する洞察を提供します。この微妙なアプローチは、単一細胞ゲノミクスの探索に対して、さらに複雑さと豊かさを付加するもう一つの層を加えるものです。 深層学習の sc-seq データ解析への応用 本節では、sc-seq データ解析のさまざまな段階を改善するための深層学習の主な応用について概説し、プロセスの重要な側面を進展させる上でのその有効性を強調します。 scRNA-seq データの補完とノイズ除去 シングルセル RNA シーケンシング（scRNA-seq）データは本質的な課題に直面しており、その中でドロップアウト事象が顕著な懸念事項となっています。これは遺伝子発現マトリックス内のスパース性（疎性）、すなわち多数のゼロ値を特徴とする状態を引き起こし、重大な問題をもたらします。このスパース性は、下流のバイオインフォマティクス解析に大きな影響を与えます。これらのゼロ値の多くは、遺伝子発現の不十分さやキャプチャ率・シーケンシング深度の低さ、あるいはその他の技術的要因など、シーケンシング手法の欠陥によって人為的に生じたものです。その結果、観測されたゼロ値は真の基礎的な発現レベルを正確に反映していません。したがって、scRNA-seq データ内のすべてのゼロ値が単なる欠損値として扱えるわけではなく、従来の統計的アプローチである欠損値の代入（imputation）とは異なる性質を持っています。真のゼロと偽のゼロのカウント間の複雑な区別を考慮すると、事前に定義された欠損値を持つ伝統的な代入手法は、scRNA-seq データに対して不十分となる可能性があります。例えば、平均代入法のような古典的な代入手法では、これらのゼロ値をその遺伝子の全細胞における平均発現レベルで置き換えることになりますが、このアプローチには、scRNA-seq データにおけるドロップアウト事象によって生じた複雑さを過度に単純化するリスクがあり、結果としてバイアスのかかった解釈を招く可能性があります。 ScRNA-seq データの補完手法は、深層学習に基づく補完手法と非深層学習に基づく補完手法の 2 つのカテゴリーに分類されます。非深層学習による補完アルゴリズムには、統計確率モデルを適合させるか、発現行列を利用して平滑化や拡散を行う方法が含まれます。この簡素さにより、特定の種類のサンプルに対して効果的なものとなっています。例えば、Wagner ら [11] は k 近傍法（KNN）を利用し、細胞間の最近傍ノードを特定して遺伝子固有のユニーク分子識別子（UMI）カウントを集約することで、遺伝子発現行列を補完しました。一方、Huang ら [12] は SVAER アルゴリズムを提案し、遺伝子間関係を活用して遺伝子発現行列を補完する手法を示しました。より大規模なデータセット（数万個以上の細胞を含む）、高次元でスパースかつ複雑な scRNA-seq データにおいては、従来の計算手法では困難に直面することが多く、これらの手法を用いた分析が困難あるいは不可能となることがあります。そのため、多くの研究者はこれらの課題に対処するために深層学習に基づく手法の設計に取り組んでいます。 dropout イベントを補完するための深層学習アルゴリズムの多くは、オートエンコーダー（AE）に基づいています。例えば、2018 年に Eraslan ら [13] は、ディープカウントオートエンコーダー（DCA）を紹介しました。DCA は、単一細胞 RNA シーケンシング（scRNA-seq）データにおける dropout イベントに対処するために、深層オートエンコーダーアーキテクチャを利用します。これは、decoder 部に確率的層を組み込むことで dropout プロセスをモデル化します。この確率的層は、dropout イベントに伴う不確実性を考慮し、モデルが補完値の分布を生成できるようにします。scRNA-seq のカウントデータの特徴を捉えるため、DCA は観測されたカウントが負の二項分布から生じるとしてモデル化します。 単一細胞変分推論（scVI）は、Lopez ら [14] によって導入された別の深層学習アルゴリズムです。scVI は、深層学習と確率モデリングを組み合わせ、scRNA-seq データの背後にある構造を捉えるための確率的変分オートエンコーダー（VAE）です。scVI は、補完やノイズ除去、および scRNA-seq データ分析に関連するさまざまなタスクに使用できます。DCA モデルとは対照的に、scVI は decoder 部でゼロ膨れ負の二項分布（ZINB）を採用し、各細胞内の各遺伝子に対する可能なカウント数の分布を生成します。ゼロ膨れ負の二項分布（ZINB）は、遺伝子発現がゼロである確率（dropout イベントをモデル化するため）と、正の値の分布（非ゼロカウントをモデル化するため）の両方をモデル化することを可能にします。 さらに、別の研究では、scScope [15] と呼ばれるモデルに再帰ネットワーク層を導入することで、scRNA-seq データの補完課題に取り組んでいます。この新しいアーキテクチャは、入力される scRNA-seq データのゼロ値エントリに対して反復的に補完処理を実行します。scScope の設計における柔軟性により、選択された再帰ステップ数（T）を通じて、補完結果を反復的に改善することが可能になります。特筆すべき点は、scScope の時間的再帰回数を 1 に制限する（すなわち T = 1）と、モデルが従来のオートエンコーダー（AE: Autoencoder）に変換されるという事実です。scScope は本質的に従来の AE の改良版であるため、その実行時間は他の AE ベースのモデルと比較して同等となります。 深層学習を scRNA-seq データの補完およびノイズ除去に適用することが特に有利である理由は、遺伝子間の非線形関係を捉える能力にあります。これは標準的な線形アプローチとは対照的であり、単一細胞ゲノミクスの文脈において、より情報に基づいた正確な補完戦略を提供する上で深層学習が優れていることを示しています。 バッチ効果の除去 シングルセルデータは、実験ラボ、プロトコル、サンプル組成、さらには技術プラットフォームが異なる多様な実験から集約されることが一般的です。これらの違いはデータ内に顕著な変動やバッチ効果をもたらすため、データ統合の過程において関心のある生物学的変動を分析する際に課題となります。この問題に対処するため、異なるバッチまたは研究からの細胞を統合する際には、技術的な分散を取り除くことでバッチ効果を補正する必要があります。バッチ補正のために最初に現れる手法は、Limma パッケージ [16] に基づく線形回帰に基づく線形的手法であり、これは removeBatchEffect 関数を提供し、直線を適合させます

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